超過90%的新發(fā)結(jié)核病（TB）病例發(fā)生在衛(wèi)生保健基礎(chǔ)設(shè)施有限的低收入和中等收入國(guó)家?？紤]到基于培養(yǎng)的檢測(cè)法需要數(shù)周才能獲得最終結(jié)果，而基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的方法需要多步工作流程以及昂貴且笨重的設(shè)備，因此開發(fā)在資源有限的環(huán)境中使用的POC檢測(cè)對(duì)于改善結(jié)核病診斷和治療以及阻止結(jié)核病傳播是十分有必要的。傳統(tǒng)的TB篩查的樣本來源是痰液，僅局限于肺結(jié)核（PTB）感染的檢測(cè)，而不適用于肺外結(jié)核（EPTB）的篩查。此外，痰液檢測(cè)對(duì)某些少菌性疾病高危人群的診斷作用有限（如幼兒和艾滋病毒感染者），其通常難以產(chǎn)生痰液或產(chǎn)生低負(fù)荷細(xì)菌的樣本，導(dǎo)致較低的檢測(cè)靈敏度?；谏鲜鰡栴}，Tulane大學(xué)醫(yī)學(xué)系的Tony Hu團(tuán)隊(duì)在《Science Translational Medicine》上發(fā)表了題為Rapid tuberculosis diagnosis from respiratory or blood samples by a low cost, portable lab-in-tube assay的研究論文。本文報(bào)道了一種價(jià)格低廉，手持式電池供電的結(jié)核分歧桿菌（Mtb）檢測(cè)裝置，可在1小時(shí)內(nèi)檢測(cè)血清、唾液和痰液樣本中檢測(cè)多種形式的結(jié)核感染。本文通訊作者的研究方向是工程多組學(xué)、納米醫(yī)學(xué)、機(jī)制驅(qū)動(dòng)的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)方法開發(fā)。
02 研究?jī)?nèi)容
本方法包含兩部分裝置，一次性使用的測(cè)定管包括測(cè)定管外殼、凍干形式的樣品液化試劑（包括裂解緩沖液）、DNA結(jié)合膜，以及Mtb DNA檢測(cè)所需的凍干形式的RPA和CRISPR-Cas12a組分；便攜式可充電電池供電的測(cè)定裝置由觸摸屏控制，包含激光器，熒光成像濾光器，一個(gè)用于讀取檢測(cè)結(jié)果的攝像頭，以及一個(gè)用于集成熒光成像和自動(dòng)化分析的Raspberry Pi微處理器。
檢測(cè)步驟如下，呼吸道樣本首先被收集在測(cè)定管中，然后將測(cè)定管轉(zhuǎn)移到便攜式裝置的孵育端口以進(jìn)行滅活和樣本前處理。然后，壓下柱塞將裂解物加載到DNA結(jié)合膜上并在該處啟動(dòng)RPA-CRISPR反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將測(cè)定管轉(zhuǎn)移到分析端口以檢測(cè)和分析所得到的熒光信號(hào)。檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)為1小時(shí)，包含樣本熱裂解、RPA-CRISPR反應(yīng)以及輸出檢測(cè)結(jié)果所需的全部步驟耗時(shí)。
對(duì)RPA-CRISPR熒光法進(jìn)行了優(yōu)化，考慮到熒光信噪比，選擇Cy5而不是FAM作為探針的熒光基團(tuán)；根據(jù)經(jīng)典的RPA-CRISPR一鍋法原理設(shè)計(jì)了不含PAM位點(diǎn)的gRNA2和gRNA3用以代替含有PAM的gRNA1，實(shí)現(xiàn)了更快的CRISPR反應(yīng)速率；凍干RPA-CRISPR試劑后，考察了用于負(fù)載的不同材質(zhì)紙基材料的優(yōu)劣，最終選擇孔徑較大的棉質(zhì)紙基材料用以原位凍干RPA-CRISPR相關(guān)試劑。然后細(xì)致考察了CRISPR反應(yīng)最適的條件，使用EnGen LbCas12a時(shí)獲得了較好的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線；在RPA緩沖體系中不添加CRISPR buffer即可獲得最優(yōu)的CRISPR反應(yīng)速率；最優(yōu)的Cas12a添加量為42 nM，Cas12a與gRNA的比例為1:1。由于全部的試劑都以凍干的形式保存，因此作者考察了不同保護(hù)劑的加入對(duì)穩(wěn)定性的影響。結(jié)果顯示當(dāng)保護(hù)劑為蔗糖、海藻糖、葡聚糖或甘露醇時(shí)，RPA-CRISPR體系復(fù)溶后具有最高的活性；繼續(xù)優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)僅加入蔗糖一種保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)組即可維持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定儲(chǔ)存，可在室溫存放2個(gè)月或4 ℃以下存放3個(gè)月之久。
接著，作者優(yōu)化了裝置設(shè)計(jì)，考察了不同包覆材料對(duì)傳熱效率的影響，以及反應(yīng)時(shí)測(cè)定管自下而上不同高度處的溫度情況，最終選擇導(dǎo)熱效率最高的聚苯乙烯泡沫塑料作為熱傳遞材料。作者羅列了該檢測(cè)裝置的構(gòu)建成本，其中占據(jù)主要成本的是光學(xué)元件，為690美金，占整個(gè)檢測(cè)裝置的87%；而可拋棄式的測(cè)定管僅需2.63美金每反應(yīng)，因此相比大型檢測(cè)儀器具有價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì)。
本方法對(duì)加標(biāo)樣本的檢測(cè)線性范圍為0.05-5000 pg/μL，還具有較高的特異性和單核苷酸多態(tài)性。在真實(shí)樣本檢測(cè)中，本方法的總檢出率為81%（27個(gè)樣本中的22個(gè)），其中肺結(jié)核性Mtb的檢出率為83%（18個(gè)樣本中的15個(gè)），肺外結(jié)核性Mtb的檢出率為75%（8個(gè)樣本中的6個(gè)）。相對(duì)的，傳統(tǒng)痰液或灌洗液培養(yǎng)法對(duì)Mtb的檢出率僅為55%（9個(gè)樣本中的5個(gè)），而GeneXpert試劑盒的檢出率也僅有68%（22個(gè)樣本中的15個(gè)）。因此本方法具有較好的臨床Mtb檢出率，在更復(fù)雜的肺外感染Mtb案例中也保持了較好的檢測(cè)性能。
此外，作者開發(fā)了一種基于DTT的樣品前處理方法，針對(duì)痰液或血清中粘度較大的蛋白，利用DTT還原這些蛋白之間的二硫鍵，從而降低樣本的粘度，使裂解后的核酸能夠更好的被釋放。結(jié)合了樣品前處理后，本方法能夠?qū)崿F(xiàn)痰液中78.1 CFU/mL的Mtb檢出，相當(dāng)于38.2 copies/μL的IS 6110編碼基因或2.4 copies/μL的Mtb基因組。該方法與GeneXpert Ultra的檢測(cè)性能在同一數(shù)量級(jí)（15.6 CFU/mL），優(yōu)于常規(guī)型GeneXpert（130 CFU/mL）。
03 研究小結(jié)
研究開發(fā)了一種用戶友好的結(jié)核桿菌檢測(cè)方法，可在1小時(shí)內(nèi)特異性檢測(cè)血液或呼吸道樣本中的Mtb。該方法具有用于樣品孵育、數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析的集成模塊，支持兒童肺結(jié)核和肺外結(jié)核（基于血清）的結(jié)核病診斷和治療監(jiān)測(cè)以及成人的呼吸道樣本分析。適用于利福平耐藥變體Mtb菌株檢測(cè)，與現(xiàn)有的診斷技術(shù)相比，該方法具有更高的靈敏度和良好的特異性。然而，該方法仍不符合WHO對(duì)POC檢測(cè)結(jié)核病診斷的最低儲(chǔ)存要求（在5-35 ℃下12個(gè)月，濕度70%），在處理血液樣本時(shí)仍需預(yù)分離操作。
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